Auf der "Informieren"-Seite von "OnLyme.org"
http://onlyme-aktion.org/informieren-2/
steht folgender Text:
Zwei Aussagen stimmen so nicht:
- Die Bezeichnung "blot" für die angewendete Technik leitet sich nicht vom der Bedeutung "klecksen, beflecken" für das Verb "to blot" ab, sondern vom Substantiv "blotting paper" für "Lösch- oder Fließpapier".
- Nicht die Antikörper, sondern die Antigene werden auf die Membran übertragen.
I.) Möglichst einfache Erläuterungen zum ersten Punkt:
In der Molekularbiologie wurden verschiedene Blotverfahren entwickelt, nämlich Western, Southern, Northern und Southwestern. Gemeinsame, allgemeine Schritte aller Blotvarianten sind:
1) Trennung eines Biomolekülgemischs (das können DNA-Fragmente, Gesamt-RNA, Proteinrohextrakte sein) nach Größe (Molekulargewicht) in einem Gel
2) Transfer dieses getrennten Gemischs auf einen festen Träger (Membran)
3) Nachweis und Auffinden der für den Experimentator interessanten Elemente im Gemisch mittels spezifischer Reagenzien
Ein gewisser Professor E. M. Southern ist der Vater aller dieser Blotverfahren.
https://de.wikipedia.org/wiki/Edwin_Southern
Der hat 1975 eine Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Fragmente entwickelt, die ihm zu Ehren als "Southern blot" bezeichnet wurde.
https://de.wikipedia.org/wiki/Southern_Blot
Diese Abbildung aus dem Wikipedia-Artikel zeigt schematisch den Transferschritt bei einem typischen Southern blot (die vorher getrennten DNA-Fragmente befinden sich im Agarosegel):
https://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Kapillarblot.svg
Ganz unten in einer Glasschale befindet sich der Transferpuffer. Im Transferpuffer liegt eine Unterlage (z.B. ein quaderförmiges Stück Plastik; schwarzgrauer Balken), auf die Schritt für Schritt der Transferaufbau zusammengebaut wird. Als erstes wird ein Stück Lösch-/Filtrierpapier auf die Unterlage gelegt, das an zwei Seiten in den Transferpuffer getaucht. Dann folgt das Agarosegel (gelber Balken), auf das die Transfermembran (roter Strich) gelegt wird. Darauf folgen einige Lagen Lösch-/Filtrierpapier, danach eine Schicht Papierhandtücher (ca. 3 cm) und als Abschluß ein Gewicht von etwa 1 kg. Dieser Aufbau wird für etwa 12 bis 16 Stunden sich selbst überlassen.
Während dieser Zeit wird die Flüssigkeit aus dem Agarosegel und dem Transferpuffer über die Membran in das Filtrierpapier und die Papierhandtücher gesogen (Kapillarkräfte), wobei auch die DNA im Gel auf die Membran übertragen wird. Bei diesem Vorgang verringert sich die Dicke des Agarosegels von anfangs etwa 0,5 cm auf unter 1 mm.
Weil bei diesem Verfahren das Löschpapier (blotting paper) eine treibende Rolle spielt, entstand der Begriff "blot" sowohl für die Technik als auch für das Endergebnis dieses dreistufigen (Trennung, Transfer und Nachweis) Experiments.
In der Folgezeit wurden ähnliche Blotverfahren für RNA- und Proteingemische entwickelt und etwas spaßhaft Northern (für RNA) und Western (für Proteine) genannt. Southwestern blots sind ein Nachweis für DNA-bindende Proteine (Trennung und Transfer von DNA-Fragmenten wie bei Southern, Nachweis ähnlich Western blots).
II.) Möglichst einfache Erläuterungen zum zweiten Punkt (Nicht die Antikörper, sondern die Antigene werden auf die Membran übertragen):
Bei einem Westernblot zur Borreliendiagnostik wird aus in vitro angezogenen Borrelien ein Proteinrohextrakt hergestellt. Dieses Proteingemisch wird in einem Gel nach der Größe/Molekulargewicht aufgetrennt und auf eine Membran übertragen. Der Diagnostikahersteller übernimmt Schritt 1 und 2 des Westernblots.
Der Laborarzt kauft fertige Membranstreifen mit aufgetrennten Borrelienproteinen und führt Schritt 3 durch (Antikörper aus dem Patientenserum reagieren mit den Borrelienantigenen auf dem Membranstreifen, die an den Borrelienantigenen haftenden Patientenantikörper werden mittels einer Farbreaktion nachgewiesen).
III.) Wie entstehen die Banden beim Western-Blot?
Die Banden entstehen nicht etwa bei der abschließenden Farbreaktion durch den Antikörpernachweis, sondern schon vorher bei der Trennung des Proteingemischs. Sie wurden nur nicht sichtbar gemacht!
Zur Veranschaulichung der obigen Aussage hier ein Bild von Schritt Nr 1: Ein Rohextrakt wurde im Gel aufgetrennt und anschließend mit einem Farbstoff (Coomassie Blau) behandelt, der alle Proteine im Gel quantitativ anfärbt. Für einen Westernblot werden allerdings ungefärbte Gele verwendet!
http://openwetware.org/wiki/Image:SDM_gel2a.tif
Spur 1: wurde ein sogenannter Molekulargewichtsmarker aufgetrennt (Gemisch aus gereinigten Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht; dient zur Abschätzung des Molekulargewichts von interessanten Proteinen in den anderen Spuren)
Spur 2: Bakterienrohextrakt: Proteine mit gleichem Molekulargewicht (gleicher Größe) laufen je nach Konzentration als schwache oder starke Striche. In Analogie zu einem Lichtspektrum werden diese Striche als Banden bezeichnet.
Spur 3: derselbe Rohextrakt wie in Spur 2; aber diesmal wurde die Produktion eines bestimmten Proteins stark induziert, das Experiment verlief erfolgreich, mit Hilfe der Marker in Spur 1 können wir die Größe des Proteins mit etwa 25 kDa angeben.
IV.) Ich hoffe, meine Erläuterungen erleichtern das Verständnis der Vorgänge im Labor.
http://onlyme-aktion.org/informieren-2/
steht folgender Text:
Zitat:Beim Westernblot (auch Immunoblot) werden Antikörper, die sich gegen spezifische Borrelia burgdorferi-Proteine richten und die man über unterschiedliche Reaktionen nachweisen kann, auf eine Membran übertragen (engl. Blotting, to blot = klecksen, beflecken). Auf einer Art Papierstreifen bilden sich sogenannte Banden.
Zwei Aussagen stimmen so nicht:
- Die Bezeichnung "blot" für die angewendete Technik leitet sich nicht vom der Bedeutung "klecksen, beflecken" für das Verb "to blot" ab, sondern vom Substantiv "blotting paper" für "Lösch- oder Fließpapier".
- Nicht die Antikörper, sondern die Antigene werden auf die Membran übertragen.
I.) Möglichst einfache Erläuterungen zum ersten Punkt:
In der Molekularbiologie wurden verschiedene Blotverfahren entwickelt, nämlich Western, Southern, Northern und Southwestern. Gemeinsame, allgemeine Schritte aller Blotvarianten sind:
1) Trennung eines Biomolekülgemischs (das können DNA-Fragmente, Gesamt-RNA, Proteinrohextrakte sein) nach Größe (Molekulargewicht) in einem Gel
2) Transfer dieses getrennten Gemischs auf einen festen Träger (Membran)
3) Nachweis und Auffinden der für den Experimentator interessanten Elemente im Gemisch mittels spezifischer Reagenzien
Ein gewisser Professor E. M. Southern ist der Vater aller dieser Blotverfahren.
https://de.wikipedia.org/wiki/Edwin_Southern
Der hat 1975 eine Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Fragmente entwickelt, die ihm zu Ehren als "Southern blot" bezeichnet wurde.
https://de.wikipedia.org/wiki/Southern_Blot
Diese Abbildung aus dem Wikipedia-Artikel zeigt schematisch den Transferschritt bei einem typischen Southern blot (die vorher getrennten DNA-Fragmente befinden sich im Agarosegel):
https://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Kapillarblot.svg
Ganz unten in einer Glasschale befindet sich der Transferpuffer. Im Transferpuffer liegt eine Unterlage (z.B. ein quaderförmiges Stück Plastik; schwarzgrauer Balken), auf die Schritt für Schritt der Transferaufbau zusammengebaut wird. Als erstes wird ein Stück Lösch-/Filtrierpapier auf die Unterlage gelegt, das an zwei Seiten in den Transferpuffer getaucht. Dann folgt das Agarosegel (gelber Balken), auf das die Transfermembran (roter Strich) gelegt wird. Darauf folgen einige Lagen Lösch-/Filtrierpapier, danach eine Schicht Papierhandtücher (ca. 3 cm) und als Abschluß ein Gewicht von etwa 1 kg. Dieser Aufbau wird für etwa 12 bis 16 Stunden sich selbst überlassen.
Während dieser Zeit wird die Flüssigkeit aus dem Agarosegel und dem Transferpuffer über die Membran in das Filtrierpapier und die Papierhandtücher gesogen (Kapillarkräfte), wobei auch die DNA im Gel auf die Membran übertragen wird. Bei diesem Vorgang verringert sich die Dicke des Agarosegels von anfangs etwa 0,5 cm auf unter 1 mm.
Weil bei diesem Verfahren das Löschpapier (blotting paper) eine treibende Rolle spielt, entstand der Begriff "blot" sowohl für die Technik als auch für das Endergebnis dieses dreistufigen (Trennung, Transfer und Nachweis) Experiments.
In der Folgezeit wurden ähnliche Blotverfahren für RNA- und Proteingemische entwickelt und etwas spaßhaft Northern (für RNA) und Western (für Proteine) genannt. Southwestern blots sind ein Nachweis für DNA-bindende Proteine (Trennung und Transfer von DNA-Fragmenten wie bei Southern, Nachweis ähnlich Western blots).
II.) Möglichst einfache Erläuterungen zum zweiten Punkt (Nicht die Antikörper, sondern die Antigene werden auf die Membran übertragen):
Bei einem Westernblot zur Borreliendiagnostik wird aus in vitro angezogenen Borrelien ein Proteinrohextrakt hergestellt. Dieses Proteingemisch wird in einem Gel nach der Größe/Molekulargewicht aufgetrennt und auf eine Membran übertragen. Der Diagnostikahersteller übernimmt Schritt 1 und 2 des Westernblots.
Der Laborarzt kauft fertige Membranstreifen mit aufgetrennten Borrelienproteinen und führt Schritt 3 durch (Antikörper aus dem Patientenserum reagieren mit den Borrelienantigenen auf dem Membranstreifen, die an den Borrelienantigenen haftenden Patientenantikörper werden mittels einer Farbreaktion nachgewiesen).
III.) Wie entstehen die Banden beim Western-Blot?
Die Banden entstehen nicht etwa bei der abschließenden Farbreaktion durch den Antikörpernachweis, sondern schon vorher bei der Trennung des Proteingemischs. Sie wurden nur nicht sichtbar gemacht!
Zur Veranschaulichung der obigen Aussage hier ein Bild von Schritt Nr 1: Ein Rohextrakt wurde im Gel aufgetrennt und anschließend mit einem Farbstoff (Coomassie Blau) behandelt, der alle Proteine im Gel quantitativ anfärbt. Für einen Westernblot werden allerdings ungefärbte Gele verwendet!
http://openwetware.org/wiki/Image:SDM_gel2a.tif
Spur 1: wurde ein sogenannter Molekulargewichtsmarker aufgetrennt (Gemisch aus gereinigten Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht; dient zur Abschätzung des Molekulargewichts von interessanten Proteinen in den anderen Spuren)
Spur 2: Bakterienrohextrakt: Proteine mit gleichem Molekulargewicht (gleicher Größe) laufen je nach Konzentration als schwache oder starke Striche. In Analogie zu einem Lichtspektrum werden diese Striche als Banden bezeichnet.
Spur 3: derselbe Rohextrakt wie in Spur 2; aber diesmal wurde die Produktion eines bestimmten Proteins stark induziert, das Experiment verlief erfolgreich, mit Hilfe der Marker in Spur 1 können wir die Größe des Proteins mit etwa 25 kDa angeben.
IV.) Ich hoffe, meine Erläuterungen erleichtern das Verständnis der Vorgänge im Labor.
